单细胞注释三种方法谁更靠谱？一次PBMC一致性分析实录

做单细胞的同学大概都被问过这样一句话：“这个簇你凭什么叫它 NK 细胞？”只用一种注释工具，答案往往是“软件这么标的”。PaperOK科研助手公开了一个在生信模式下真实运行的案例：对健康人外周血单个核细胞（PBMC）同时用 CellTypist、SingleR 和经典 Marker 基因三种方法注释，再把结果放到同一套口径下比较，哪里一致、哪里打架、为什么打架，都写进了一份中文报告。案例使用的是公开数据，下面按运行顺序还原整个过程。

先把数据和环境理干净

提问仅一句话：“请帮我基于CellTypist、SingleR和经典的Marker基因，实现健康人PBMC的细胞类型注释一致性分析”。科研助手并没有直接开跑，而是先下载10x Genomics公开的PBMC 3k数据核对md5，并在个独立的Python环境中安装scanpy、CellTypist和SingleR，并不动用户电脑上的环境。对于经常饱受依赖冲突折磨的生信小白来说，这一步省下来的时间可能会比后续的分析还要多。

质控参照scanpy官方教程阈值，最后保留2,638个细胞。疑似双细胞只使用Scrublet进行标记而不去除，由研究者自行决定。经过归一化、降维后，Leiden聚类得到了8个簇。三种注释方法随后都以同一份归一化矩阵作为输入，避免“输入不同导致结果不同”混进比较里。

三套标签，怎么放在一起比

三种方法的来源分别是CellTypist（Immune_All_Low模型）、SingleR（Monaco免疫参考集）和Marker（14组经典免疫签名评分）。问题在于它们的名称分类粗细程度不一样，有的非常细致，有的只是大类，用字符串比较的话一致性会严重偏低。

科研助手将三个标签合并为一套16个类别的标签，然后分别计算细胞水平和簇水平的一致率、Cohen’s κ、ARI和NMI。几个指标只看一面：一致率高，κ排除了偶然性，ARI和NMI注重分组结构的匹配度。之所以要同时算逐细胞和簇两个层面，是因为簇水平的多数投票会把簇内的少量异质细胞“抹平”，两个层面的数字放在一起，才能看出分歧是集中在个别细胞，还是整个簇都存在争议。

分歧最大的簇，原因找到了

一致性分析最有价值的地方在于解释不一致之处。报告逐个追查最大分歧的簇，最典型的是簇5，在经典的Marker基因点图上，这个簇高表达了NK细胞的细胞毒基因，而Marker方法将其标记为红细胞（Erythroid）。

科研助手检查签名本身，发现红细胞签名的6个基因中有5个在质控时被过滤掉。剩下一个基因支撑的打分太不稳定了，所以产生了这个误判。这个结论不难得出，但单看一张UMAP图就容易被忽略了。它同样也提示我们基于Marker打分的注释需要考虑到签名基因在数据中剩余了多少。

交付的是能复现的项目

运行结束后，项目文件夹里留下了完整的一套材料：

报告和图片可在应用右侧直接预览，本轮新增和修改文件逐个罗列，不满意可一键撤销。整个过程执行的命令、安装的包都能在「工作过程」中查看。

需要说明的是，三种方法谁“更靠谱”并没有一个通用答案。参考集匹配组织来源、签名基因保留与否、分类粒度定多细，都会影响结果。在这个案例中，它并没有提供一个排名，而是提供了一个公开分歧的程序。最后每个簇叫什么，还需要研究者运用自己的生物学知识进行判断。生信模式中内置了25个生信插件与分析内核，第一次进入会自动进行安装，如果你也有一堆待注释的单细胞数据进行发愁的话，不妨从这个问题出发。